मेलानोतन I की ठोस-चरण संश्लेषण विधि

पृष्ठभूमि

मेलानोटन I, जिसे अफ़मेलनोटाइड के नाम से भी जाना जाता है, 13 अमीनो एसिड से बना एक रैखिक पॉलीपेप्टाइड है जो फार्मास्युटिकल अनुसंधान में तेजी से महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए तैयार है। मेलानोतन I के लिए प्राथमिक अंग्रेजी नाम मेलानोतन-1 और एफेमेलनोटाइड हैं। α-मेलानोसाइट-उत्तेजक हार्मोन α-MSH के सिंथेटिक एनालॉग के रूप में, मेलानोतन I का उपयोग एरिथ्रोपोएटिक प्रोटोपोर्फिरिया के कारण होने वाली प्रकाश संवेदनशीलता विकारों के इलाज के लिए किया जा सकता है। वर्तमान में, अधिकांश मेलानोतन I उत्पादों को केवल अनुसंधान उपयोग के लिए लेबल किया गया है और अभी तक मानव अनुप्रयोग के लिए अभिप्रेत नहीं है। पारंपरिक ठोस-चरण संश्लेषण में, राल की पसंद युग्मन क्षमता और उत्पाद की अंतिम शुद्धता पर महत्वपूर्ण प्रभाव डालती है।

मूल जानकारी

चीनी नाम: मेलानोतन 1
अंग्रेजी नाम: मेलानोतन-1
कंपनी नंबर: GT-A006
कैस नं.: 75921-69-6
अनुक्रम: SYS{Ne}EH{D-Phe}RWGKPV-NH2
आणविक सूत्र: C78H111N21O19
आणविक भार: 1646.88

 तैयारी विधि

मैं। एफएमओसी-वैल-एमिनो राल की तैयारी

स्टेप 1:0.45mmol/g की प्रतिस्थापन डिग्री के साथ 11.11g (5mmol) रैमेज एमाइड AM रेज़िन का वजन करें और इसे एक ठोस-चरण रिएक्टर में जोड़ें। राल को 30 मिनट तक फुलाने के लिए डीसीएम डालें, फिर छान लें। डीएमएफ से तीन बार धोएं। 20% पाइपरिडीन (वी/वी) युक्त डीएमएफ समाधान जोड़ें और 5 मिनट तक प्रतिक्रिया करें। एक और 20% पाइपरिडीन डीएमएफ समाधान जोड़ें और बीच में एक डीएमएफ वॉश के साथ 10 मिनट तक प्रतिक्रिया करें। प्रतिक्रिया पूरी होने के बाद, पानी निकालें और डीएमएफ से तीन बार धोएं।

चरण दो:0°C पर DMF में 5.09 ग्राम Fmoc-Val-OH, 2.02 ग्राम HOBT (1-हाइड्रॉक्सीबेंज़ोट्रायज़ोल), और 2.32 ml DIC (N,N'-diisopropylcarbodiimide) को DMF में घोलें। पूर्ण विघटन के बाद, मिश्रण को प्रतिक्रिया स्तंभ में जोड़ें और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया करें। नकारात्मक परिणाम सुनिश्चित करते हुए, निनहाइड्रिन परीक्षण का उपयोग करके प्रतिक्रिया की प्रगति की निगरानी करें। प्रतिक्रिया पूरी होने के बाद, एफएमओसी-वैल-एमिनो राल प्राप्त करने के लिए डीएमएफ से तीन बार धोएं।

द्वितीय. मेलानोतन I के पूर्णतः संरक्षित रेज़िन पेप्टाइड की तैयारी।

स्टेप 1:उपरोक्त Fmoc-Val-aminoresin में DMF घोल (मात्रा अनुपात) में 20% पाइपरिडीन मिलाएं। 5 मिनट के लिए प्रतिक्रिया करें, फिर डीएमएफ समाधान में 20% पाइपरिडीन का एक और भाग जोड़ें और 10 मिनट के लिए प्रतिक्रिया करें। अंतराल के दौरान एक बार डीएमएफ से धोएं। प्रतिक्रिया पूरी होने के बाद, वैक्यूम के नीचे सुखाएं और डीएमएफ से तीन बार धोएं।

चरण दो:0°C पर DMF में 5.06g Fmoc-Pro-OH, 2.02g HOBT (1-हाइड्रॉक्सीबेंज़ोट्रायज़ोल), और 2.32ml DIC (N,N'-diisopropylcarbodiimide) घोलें। पूर्ण विघटन के बाद, मिश्रण को प्रतिक्रिया स्तंभ में जोड़ें और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया करें। नकारात्मक परिणाम प्राप्त होने तक निनहाइड्रिन परीक्षण (कैसर परीक्षण) का उपयोग करके प्रतिक्रिया की प्रगति की निगरानी करें। पूरा होने पर, Fmoc-Pro-Val-aminoresin प्राप्त करने के लिए DMF से तीन बार धोएं।

चरण 3:चरण 2 में वर्णित विधि का पालन करते हुए, मेलानोटन I के अनुक्रम के अनुसार प्रत्येक अमीनो एसिड को क्रमिक रूप से जोड़ें। एसी-सेर (टीबीयू) -ओएच युग्मन प्रतिक्रिया के पूरा होने के बाद, डीएमएफ के साथ तीन बार, डीसीएम (डाइक्लोरोमेथेन) के साथ तीन बार, और मेथनॉल के साथ तीन बार धोएं। 23.89 ग्राम पूरी तरह से संरक्षित मेलानोतन I रेज़िन-बाउंड पेप्टाइड प्राप्त करने के लिए वैक्यूम के नीचे सुखाएं।

तृतीय. मेलानोतन I क्रूड पेप्टाइड की तैयारी
23.89 ग्राम पूरी तरह से संरक्षित मेलानोतन I राल-बाउंड पेप्टाइड को एक गोल-तले फ्लास्क में रखा गया था। 0°C पर, पहले से तैयार क्लीवेज कॉकटेल का 250 मिलीलीटर (मात्रा के हिसाब से TFA: थियोएनिसोल: फिनोल: ट्राइसोप्रोपिलसिलेन: पानी = 82.5: 7.5: 5: 3: 2 से बना) धीरे-धीरे हिलाते हुए मिलाया गया। मिश्रण को कम तापमान पर 0.5 घंटे तक प्रतिक्रिया दी गई, इसके बाद कमरे के तापमान पर 2 घंटे तक प्रतिक्रिया की गई। दरार समाधान को फिर वैक्यूम के तहत फ़िल्टर किया गया था। इस घोल को हिलाते हुए धीरे-धीरे 2 लीटर बर्फ-ठंडे निर्जल डायथाइल ईथर में मिलाया गया। क्रूड पेप्टाइड को निस्पंदन द्वारा अलग किया गया, बर्फ-ठंडे डायथाइल ईथर से तीन बार धोया गया, और 8.55 ग्राम मेलानोतन I क्रूड पेप्टाइड प्राप्त हुआ।

चतुर्थ. मेलानोतन I शुद्ध पेप्टाइड की तैयारी
स्टेप 1:क्रूड मेलानोतन I पेप्टाइड को 100 मिलीलीटर शुद्ध पानी में घोलें और क्रूड पेप्टाइड घोल प्राप्त करने के लिए 0.45 माइक्रोन झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर करें।

चरण दो:उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) का उपयोग करके कच्चे मेलानोटन I पेप्टाइड को शुद्ध करें। मोबाइल चरण ए (0.05% ट्राइफ्लूरोएसेटिक एसिड जलीय घोल) और मोबाइल चरण बी (एसीटोनिट्राइल में 0.05% ट्राइफ्लूरोएसेटिक एसिड) के साथ डीएसी-एचबी50 गतिशील अक्षीय संपीड़न कॉलम का उपयोग करें। पृथक्करण और शुद्धिकरण के लिए क्रमिक क्षालन करें। यूवी डिटेक्टर का उपयोग करके नमूने का पता लगाएं और अंशों में लक्ष्य शिखर के अनुरूप पेप्टाइड समाधान एकत्र करें।

चरण 3:एचपीएलसी शुद्धि के बाद, 99% से अधिक शुद्धता के साथ 180 मिलीलीटर मेलानोतन I ट्राइफ्लूरोएसेटेट समाधान प्राप्त करें। रोटरी वाष्पीकरण के माध्यम से घोल को 50 मिलीलीटर तक सांद्रित करें।

चरण 4:विआयनीकृत पानी के साथ क्रोमैटोग्राफी कॉलम को संतुलित करें और शुद्ध मेलानोतन I ट्राइफ्लूरोएसेटेट समाधान (शुद्धता> 99%) के 50 मिलीलीटर लोड करें। 2% एसिटिक एसिड जलीय घोल प्रणाली में 50 मिनट तक घोलें। एकत्रित लक्ष्य उत्पाद को रोटरी वाष्पीकरण के माध्यम से 80 मिलीलीटर तक केंद्रित करें। 32.33% की उपज के साथ अंततः 5.33 ग्राम मेलानोतन I शुद्ध पेप्टाइड प्राप्त करने के लिए प्री-फ़्रीज़ सुखाने और फ़्रीज़-सुखाने का कार्य करें।