झल्लाहट पेप्टाइड प्रौद्योगिकी

प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (FRET)

प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरईटी) एक गैर-विकिरण ऊर्जा हस्तांतरण प्रक्रिया है जिसमें दाता उत्तेजित राज्य ऊर्जा को अंतर-आणविक विद्युत जोड़ों की बातचीत के माध्यम से स्वीकर्ता उत्तेजित राज्य में स्थानांतरित किया जाता है।इस प्रक्रिया में फोटॉन शामिल नहीं होते हैं और इसलिए यह गैर-विकिरणात्मक है।इस परख के तेज़, संवेदनशील और सरल होने के फायदे हैं।

FRET परख में प्रयुक्त डाई समान हो सकती है।लेकिन अधिकांश अनुप्रयोगों में, वास्तव में विभिन्न रंगों का उपयोग किया जाता है।संक्षेप में, चमकदार अनुनाद ऊर्जा का स्थानांतरण दाता समूह के उत्तेजित होने पर दाता (डाई 1) से स्वीकर्ता (डाई 2) तक द्विध्रुवों की एक जोड़ी का स्थानांतरण है।सामान्य तौर पर, डोनर फ्लोरोफोर समूह का उत्सर्जन स्पेक्ट्रम स्वीकर्ता समूह के अवशोषण स्पेक्ट्रम के साथ ओवरलैप होता है।"जब दो फ्लोरोफोर्स के बीच की दूरी उचित (10 - 100 ए) होती है, तो दाता से स्वीकर्ता तक फ्लोरोफोर ऊर्जा का स्थानांतरण देखा जा सकता है।"ऊर्जा हस्तांतरण की विधि रिसेप्टर की रासायनिक संरचना पर निर्भर करती है:

1. आणविक कंपन में परिवर्तित हो जाता है, अर्थात ऊर्जा हस्तांतरण की चमकदार रोशनी गायब हो जाती है।(रिसेप्टर एक प्रकाश बुझाने वाला है)

2. उत्सर्जन रिसेप्टर की तुलना में अधिक तीव्र होता है, जिसके परिणामस्वरूप द्वितीयक प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम में रेडशिफ्ट होता है।(रिसेप्टर चमकदार उत्सर्जक हैं)।

दाता समूह (EDANS) और स्वीकर्ता जीन (DABCYL) एचआईवी प्रोटीज के प्राकृतिक सब्सट्रेट से समान रूप से जुड़े हुए हैं, और जब सब्सट्रेट अलग नहीं होता है, तो DABCYL EDANS को ख़त्म कर सकता है और फिर फ्लोरीन के लिए अवांछनीय हो सकता है।HIV-1 प्रोटीज़ वियोग पर, EDANS अब DABCYL द्वारा बुझता नहीं है, और EDANS ल्यूसिफ़ेरेज़ का बाद में पता लगाया जा सकता है।EDANS की प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन करके प्रोटीज़ अवरोधकों की उपलब्धता की निगरानी की जा सकती है।

पेप्टाइडेज़ गैर-विशिष्टता का अध्ययन करने के लिए FRET पेप्टाइड्स सुविधाजनक उपकरण हैं।चूँकि इसकी प्रतिक्रिया प्रक्रिया की लगातार निगरानी की जा सकती है, यह एंजाइम गतिविधि का पता लगाने के लिए एक सुविधाजनक तरीका प्रदान करता है।दाता/स्वीकर्ता द्वारा पेप्टाइड बांड के हाइड्रोलिसिस के बाद उत्पन्न चमक नैनोमोलर सांद्रता पर एंजाइम गतिविधि का एक माप प्रदान करती है।जब FRET पेप्टाइड बरकरार रहता है, तो यह आंतरिक फ्लैश के अचानक गायब होने को दर्शाता है, लेकिन जब दाता/स्वीकर्ता के विपरीत कोई पेप्टाइड बंधन टूट जाता है, तो यह एक फ्लैश छोड़ता है, जिसे लगातार पता लगाया जा सकता है और फिर एंजाइम गतिविधि को निर्धारित किया जा सकता है।